霸王龙的软组织和蛋白质保存机制

关于软组织结构和天然蛋白质可以在整个地质时期内保存的现有观念存在争议，因为这种保存方法尚待研究和明确定义。在一项新研究中，美国工程，古生物学，生物科学，材料与工程和美国先进光源部门的Elizabeth M. Boatman及其同事测试了保存的组织结构的交联机制。他们使用两种非酶结构蛋白机制，芬顿化学和糖基化来证明其可能的作用，以保护从霸王龙（T. rex）皮质骨中恢复的血管结构。; USNM 555 000，以前是MOR 555）。他们通过成像，衍射，光谱学和免疫组织化学证明了化石血管组织的内生性（随机性）以及最外层血管层中I型胶原的存在。

他们从霸王龙容器的同步加速傅立叶变换红外（SR-FTIR）研究中获得数据，以分析其交联特性，并将其与用两种技术相似处理过的对照鸡样品进行比较。研究人员提供了化石组织化学状态的X射线微探针分析，以支持霸王龙的血管保存，这是使用研究方法所观察到的。船夫等。他提出，观察到的组织稳定交联将在中生代骨骼成分中保留其他微血管组织方面发挥重要作用。该工作现已发表在《科学报告》上。

古生物学家已经从包括非禽类恐龙在内的化石脊椎动物的骨骼中恢复了空心，柔韧，透明的血管状结构，并应用了许多技术来鉴定其内源蛋白质，例如胶原蛋白和弹性蛋白。研究人员使用质谱测序法来鉴定从非禽类恐龙中回收的分离的血管，以支持过去存在脊椎动物特异性血管蛋白。例如，他们记录了通过脱盐释放蛋白质后I型胶原蛋白典型的标志性67纳米带状分布随后进行了进一步的研究，利用FTIR和Raman分析验证了大约1.9亿年前蜥脚类恐龙肋骨的血管中I型胶原的存在。尽管研究团队已经开发出多种方法来解释意外的保存，但对拟议机制的实验测试仍需要常规且广泛地进行。

在目前的工作中，Boatman等人。确定并测试了一组实验的可能贡献，这些实验可保持霸王龙化石的紧凑型骨的器皿状结构。他们希望这项工作为进一步研究保存从中生代或更近的化石中回收的软组织奠定基础。脊椎动物血管壁包含三个不同的层，包括内膜（最内层），中膜和外膜（最外层）。由于其独特的分子组成，科学家可以在形态上和化学上区分这些成分。例如，弹性蛋白是一种针对脊椎动物的螺旋蛋白，可抵抗压力变化在血管壁上。胶原蛋白也是脊椎动物特有的，并且构成血管的主要部分以用作其结构基础。由于弹性蛋白和胶原蛋白具有在分子结构和组成上可识别的标志性特征，因此，Boatman等人（2006年）发表了论文。建议研究残余恐龙血管内的两种蛋白质。

左：SR-FTIR分析。SR-FTIR光谱中未处理和已处理的鸡I型胶原的酰胺I亚带定位。图中显示了子带（β-折叠，〜1633 cm-1；三螺旋，〜1658-1660 cm-1；分子间，〜1683-1690 cm-1）。红色痕迹表示实验曲线的二阶导数。尽管分子间子带通常以较低的波数出现，但识别的值是每个二阶导数迹线中最接近的局部最小值，并且始终出现在所有样本中。因此，在此样本中，分子间子带的索引为1697-1699 cm-1。右：USNM 555000皮质骨的SEM图像。（a）骨折表面表现出明显的骨质特征（o）主要是在纵切面，腔隙性骨腔（ol；白色虚线圆），质地细腻，与骨骼中矿化的胶原纤维一致。背向散射（BSE）图像。（b），抛光的（1200粒度）横截面（BSE图像）显示出清晰的骨质和骨细胞腔特征。充满矿物质的骨质骨（白色箭头）产生高度改变的血管结构，通过精心准备（沉淀，洗涤，在显微镜下选择）可以轻松地从SAXS，FTIR和TEM分析中消除。裂纹是由于湿度/压力的变化而引起的，并且是制备的假象。（c），抛光的（1200粒度）横截面（二次电子[SE]图像）显示出清晰的骨质和骨细胞腔特征。（d）骨的SE高度放大图像，在边缘显示纤维纹理（白色箭头），该现象通常在该样品的非矿物填充骨中观察到。这么薄 骨结构内部的纤维涂层被提议为中空的，柔软的血管结构。信用：科学报告，doi：10.1038 / s41598-019-51680-1
该研究小组假设早期的成岩作用（物理和化学作用）对霸王龙微血管从深部存活的贡献。为了测试这一点，Boatman等人。首先进行了SR-FTIR分析，以了解其鸡I型胶原蛋白对照样品中的交联特性。他们使用Fenton试剂或离子催化糖基化技术诱导蛋白质中的交联，然后使用传输SR-FTIR测试每个组织。他们观察到在鸡组织中形成的分子内交联是不成熟的，因为它们没有暴露于形成分子间交联或高级糖基化终产物（AGEs）所必需的途径。

为了测试霸王龙血管内源蛋白的结构，科学家从脱矿质的霸王龙皮质骨中释放出三种类型的血管。然后，他们使用可见光显微镜（VLM）将其表征为：

广泛的棕褐色柔韧性网络
碎片状的不透明结构
碎片半透明结构
他们将能量色散X射线光谱仪（EDS）与扫描电子显微镜（SEM）以及微聚焦X射线荧光（µXRF）光谱仪结合使用，以确认在不同组成的组织样本中观察到的差异。该团队专注于柔韧的血管网络，因为它们类似于现有的骨骼组织，大概保持了最小的变化。

左：霸王龙血管组织的显微图像和原纤维胶原蛋白条带的相关分析。（a）霸王龙软组织的透射VLM显示出广泛的中空，柔韧性，血管结构和典型的棕色色调网络。（b）容器表面的SEM图像。（c）（b）细节特征与胶原纤维束（胶原纤维，“ f”；胶原纤维，“ CF”）一致的放大图像。测量的平均原纤维宽度为110nm，并且平均纤维宽度为1.0μm。（d）在纵向血管横截面中观察到的纤维特征的TEM图像。（e）c框1和2和c以及（f）3、4、5 in框（d）中带状纹理的强度曲线，具有示例峰峰距离（SEM平均值为〜74 nm; TEM为〜56 nm ）以红色标注。右图：有机物的图像和化学分析，组织脱矿质后，褐色的霸王龙血管和矿化的血管系统释放。（a），从霸王龙中释放出来的典型血管碎片的光学显微镜图像。（b），a中白色矩形的放大图像，描绘了褐色，柔韧的有机容器（ov）碎片和两种类型的矿化铸件：不透明形式和半透明形式。（c），类似血管碎片的SEM图像。（d），c中白色矩形的放大图像，其中已识别出三种血管碎片类型，并在e中明确了EDS分析的位置。（e），EDS分析确定不透明的容器铸件为氧化铁形式（底部，红色），半透明的容器铸件为BaSO4（顶部，蓝色）。信用：从霸王龙中释放出来的典型血管碎片的光学显微镜图像。（b），a中白色矩形的放大图像，描绘了褐色，柔韧的有机容器（ov）碎片和两种类型的矿化铸件：不透明形式和半透明形式。（c），类似血管碎片的SEM图像。（d），c中白色矩形的放大图像，其中已识别出三种血管碎片类型，并在e中明确了EDS分析的位置。（e），EDS分析确定不透明的容器铸件为氧化铁形式（底部，红色），半透明的容器铸件为BaSO4（顶部，蓝色）。信用：从霸王龙中释放出来的典型血管碎片的光学显微镜图像。（b），a中白色矩形的放大图像，描绘了褐色，柔韧的有机容器（ov）碎片和两种类型的矿化铸件：不透明形式和半透明形式。（c），类似血管碎片的SEM图像。（d），c中白色矩形的放大图像，其中已识别出三种血管碎片类型，并在e中明确了EDS分析的位置。（e），EDS分析确定不透明的容器铸件为氧化铁形式（底部，红色），半透明的容器铸件为BaSO4（顶部，蓝色）。信用：相似血管碎片的SEM图像。（d），c中白色矩形的放大图像，其中已识别出三种血管碎片类型，并在e中明确了EDS分析的位置。（e），EDS分析确定不透明的容器铸件为氧化铁形式（底部，红色），半透明的容器铸件为BaSO4（顶部，蓝色）。信用：相似血管碎片的SEM图像。（d），c中白色矩形的放大图像，其中已识别出三种血管碎片类型，并在e中明确了EDS分析的位置。（e），EDS分析确定不透明的容器铸件为氧化铁形式（底部，红色），半透明的容器铸件为BaSO4（顶部，蓝色）。信用：科学报告，doi：10.1038 / s41598-019-51680-1
当船夫等。使用SEM 研究了柔韧的霸王龙血管，他们观察到了最外层的纤维结构。合并的特征与从皮质骨释放的现有血管和原纤维胶原中观察到的特征一致。该小组分析了霸王龙血管的SR-FTIR光谱，以检测在治疗的现存和古老组织中观察到的显性谱带。值得注意的是，恐龙组织的酰胺I带位于与成熟的（交联的）原纤维胶原相一致的主要α-螺旋结构上。然后，研究小组进行了免疫组织化学（IHC）研究，以鉴定弹性蛋白和I型胶原蛋白的蛋白质特异性表位。

科学家产生了针对现有脉管系统所有组件的抗体，以观察到恐龙血管壁上的正向结合。他们使用荧光滤光片捕获了抗体-抗原复合物的定位和分布（绿色荧光）。恐龙血管对肌动蛋白抗体的反应表现为薄而均匀分布的层。针对肌肉蛋白原肌球蛋白产生的抗体以更高的强度出现在血管壁上。尽管弹性蛋白抗体显示出更高的强度，但恐龙血管也表明存在I型胶原蛋白抗体。由于高度的进化保守性，这两种蛋白质是化石研究的良好靶标在某些地区。他们没有观察到恐龙血管对细菌肽聚糖抗体的反应性（表明无微生物污染）。

霸王龙组织显示出与现存血管组织的蛋白质成分结合的阳性抗体。（a，c，e，g，i，k，m，o）是合成图像，其中对应于抗体-抗原复合物的荧光重叠在血管切片的VLM图像上，相邻图像（b，d，f，h， j，l，n，p）使用荧光滤光片捕获。（a–d）阴性对照未观察到虚假结合，在阴性对照中，血管暴露于针对所用其他所有抗体（例如小鼠（a，b）和兔（c，d））的宿主物种产生的二抗。（e，f）在薄而均匀分布的层中可以看到恐龙血管与肌动蛋白抗体的正结合，而（g，h）肌肉原肌球蛋白抗体的结合更广泛。（i，j）I型胶原和（k，l）弹性蛋白的抗体均与这些霸王龙血管阳性结合。（m，n）针对鸵鸟血红蛋白的抗体表现出相对较低的结合强度。（o，p）未观察到恐龙容器与针对细菌肽聚糖的抗体的反应性（表明无污染）。信用：科学报告，doi：10.1038 / s41598-019-51680-1
船夫等。测试霸王龙的血管结构，以了解验尸后结构蛋白的交联是否增强了它们对降解或成岩作用的抵抗力。为此，他们使用SR-FTIR透射光谱研究了原纤维胶原蛋白，以提示组织结构保存过程中的验尸交联。这些光谱特征以前被记录过，但没有与侏罗纪的sauropodomorphmorphs和白垩纪骨讨论。然后，科学家处理散装霸王龙组织与硼氢化钠（添加NaBH 4）以减少未成熟交联中的羰基并增加非肽羰基的吸收强度。霸王龙组织中的碳水化合物吸收带与AGEs（高级糖化终产物）一致。治疗后，数据表明霸王龙组织同时具有分子内和分子间交联类型。

当科学家使用µXRF对组织中的元素进行标测时，他们发现铁（Fe）是恐龙血管组织中唯一浓缩的金属，同时记录了半透明血管铸模中的钡（Ba）。使用扩展的X射线吸收近边缘结构显微镜，他们观察到Fe 3+嵌入血管壁。研究人员表明存在细微的针铁矿（α-FeO​​（OH））。一种先前在两个不同的恐龙标本中检出的血管组织中的矿物。

页首：霸王龙血管组织的SR-FTIR分析，NaBH4减少霸王龙血管组织，未经处理的鸡I型胶原蛋白以及用Fenton试剂和铁催化糖基化处理的鸡I型胶原蛋白。（a，b）所有五个样品在非肽羰基和蛋白质酰胺I区的平均FTIR光谱。（a）用NaBH4处理霸王龙的血管组织后，非肽羰基带显着减少，从而减少了（未成熟的）肽交联。恐龙组织的蓝移酰胺I带，Fenton试剂处理过的I型鸡胶原蛋白和铁催化糖基化处理过的I型鸡胶原蛋白表明，随着能量的增加，α-螺旋结构（〜1660 cm-1）增加三螺旋和分子间子带越来越占主导地位。醛羰基的发展 两种处理过的鸡组织中的酮醛和/或未成熟的酮亚胺带均与恐龙组织中的强羰基带一致。底部：有机和矿化的霸王龙血管组织的微X射线荧光（u-XRF）绘图显示了多种金属的存在。硫，铁和钡是容器样品中鉴定出的主要元素。两个（a，b表示Ba和Fe）和三个（c，d表示S，Ba和Fe）原子种类的复合图显示，Fe主要与有机血管组织相关，而S和Ba主要与有机血管组织相关。半透明的矿化容器铸件。信用：有机和矿化的霸王龙血管组织的微X射线荧光（u-XRF）绘图显示了多种金属的存在。硫，铁和钡是容器样品中鉴定出的主要元素。两个（a，b表示Ba和Fe）和三个（c，d表示S，Ba和Fe）原子种类的复合图显示，Fe主要与有机血管组织相关，而S和Ba主要与有机血管组织相关。半透明的矿化容器铸件。信用：有机和矿化的霸王龙血管组织的微X射线荧光（u-XRF）绘图显示了多种金属的存在。硫，铁和钡是容器样品中鉴定出的主要元素。两个（a，b表示Ba和Fe）和三个（c，d表示S，Ba和Fe）原子种类的复合图显示，Fe主要与有机血管组织相关，而S和Ba主要与有机血管组织相关。半透明的矿化容器铸件。信用：而S和Ba主要与半透明的矿化器皿铸件有关。信用：而S和Ba主要与半透明的矿化器皿铸件有关。信用：科学报告，doi：10.1038 / s41598-019-51680-1
这样，伊丽莎白·M·博特曼及其同事证明了软组织恐龙结构内存在脊椎动物物种内源性蛋白质。其中包括与现存脊椎动物脉管系统一致的 I型胶原蛋白的存在。数据支持生物体死亡后稳定生物分子和血管结构的两步机制，以促进其在骨骼元素中的保存。该团队假设铁介导的芬顿和糖基化途径可能有助于增强霸王龙血管内和周围的弹性蛋白和纤维状胶原的组织寿命。这两个过程都可以被过渡金属物质（例如铁）催化，以定义铁在结构蛋白交联中的核心作用。羟基氧化铁沉淀的形成完全支持了这一想法。

数据代表了从霸王龙标本USNM 555000 中回收的血管组织的首次全面化学和分子表征。结果阐明了在分子水平上可能发生的化石过程。研究人员认为，已证明的技术将有助于开发综合机制，以长期稳定地保持血管组织在深夜的存活。